环形RNA是mRNA在剪接的过程中，上游exon的5’端与下游exon的3’端剪接到一起，从而形成的首尾相接的环状RNA分子。近来的研究表明，高等动物中环状RNA的种类和含量远远超过预期。最近的研究发现circularRNA可以作为“microRNA海绵”，竞争结合microRNA从而解除这些microRNA对其他靶标的调控；同时保守型分析发现环状RNA上潜在具有多种RNA结合蛋白的结合位点，暗示circularRNA可以调控RNA结合蛋白的功能。更为重要的是，circularRNA的表达呈现出很强的组织特异性，暗示这些circularRNA具有重要的生物学功能。但目前对circularRNA的研究刚刚起步，这类RNA的生物学功能还有待挖掘，因此是一个值得深入的研究方向。 环状RNA特点 大多存在于细胞质中，且序列高度保守； 一般细胞或组织中，环状RNA较稳定，半衰期在48h，其他mRNA（线性）半衰期约为10h。 不同细胞中表达的环状RNA可能不同； 同一个基因可能即产生线性mRNA，又可以转录成环状RNA; 总量估计，外显子环状RNA（exoniccircRNA）的量约为polyAmRNA（线性mRNA）的1%；占所有非核糖体RNA的0.8%； 大部分为ncRNA。 样本要求 样本类型：细胞、新鲜组织或足量totalRNA 样品量：≥5ug纯化后的totalRNA（需保证提供的细胞及组织样本可以提取到足量RNA），最低浓度不低于50ng/μl 样本质量：OD260/280值应在1.9～2.2之间；DNA应该去除干净，RNA无降解；RIN值大于等于7 样品保存运输：RNA用离心管保存，封口膜封口后用干冰运输，组织样品则用冻存管保存，干冰或液氮运输 实验流程 检测原理 通过高通量测序技术检测circRNA最关键的原理是寻找反向剪接的reads，即back-splicingreads。 数据分析 分析结果 1.circRNA预测及数目统计 应用Memczak等[1]的方法进行circRNA的预测。每个样本mapping到基因组各个染色体的reads以及back-splicingreads可以通过圈图展示。 图1.基因组覆盖分布图。 以1K的窗口得出基因组的一个覆盖分布，图中最外圈为基因组，里面每一个圈表示一个样本的染色体reads覆盖，其中红色代表该样本中back-splicingreads的覆盖情况。 对所有预测获得的circRNA与circBase数据库[2]的已知circRNA的位置信息进行比较，可以区分出新预测出来的novelcircRNA和已知的knowncircRNA，统计如下： 2.circRNA表达定量及差异分析 目前，对于绝大多数的circRNA而言都无法获得其完整的序列[3]，因此只能用circRNA的back-splicing位点处的junctionreads来计算其表达量，这里我们采用SRPBM[4]对reads进行归一化处理。用edgeR[5]软件计算筛选差异表达的circRNA，得出p-value后进行多重假设检验校正，通过控制FDR（FalseDiscoveryRate）来决定p-value的阈值，校正后的p-value即q-value。 图2.circRNA差异表达散点图和火山图3.circRNA关联基因的GO和KEGG富集分析 根据circRNA的位置信息，可以获得与circRNA所在基因组位置上相关联的蛋白编码基因，然后我们对差异circRNA所对应的基因进行GO和KEGG富集分析。 图3.circRNA关联基因的GO富集散点图 图4.circRNA关联基因的KEGG富集散点图4.circRNA-miRNA靶向预测及网络构建 用miRanda软件[6]预测差异表达circRNA与miRNA的靶向结合关系，并绘制网络图。 图5.circRNA-miRNA相互作用网络图

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